摘要:為了充分發(fā)揮和提高優(yōu)良種公羊的利用率，提高綿羊凍融精液品質(zhì)，試驗(yàn)采用酶動(dòng)力學(xué)分光度法對(duì)冷凍保存前后小尾寒羊精子和精清中ATP酶活性變化進(jìn)行研究。說(shuō)明凍融過(guò)程對(duì)綿羊精子中ATP酶的活性造成了嚴(yán)重?fù)p傷。綿羊凍融精子ATP酶的活性可以在一定程度上預(yù)測(cè)精子活率，并可作為綿羊精液品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。MVE液氮罐

1材料與方法

1.1主要試劑

甘油、D-（+）-葡萄糖、蔗糖、青霉素、鏈霉素，檸檬酸鈉、氯化鈉、0.2%TritonX-100、Tris-HCl緩沖液（0.1mol/L，pH值8.2）、ATP溶液，分析純。

1.2主要儀器

高速離心機(jī)（型號(hào)為ZONKIAHC–2518），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)為T(mén)U-1810PC/SPC），顯微鏡（型號(hào)為CKX31）。

1.3稀釋液的配制

取基礎(chǔ)液（葡萄糖3g，蔗糖4g，檸檬酸鈉3g，超純水100mL，煮沸消毒）80mL，加20mL新鮮卵黃液，青霉素、鏈霉素各10萬(wàn)IU配制成保存稀釋液；再取上述溶液94mL加入甘油6mL，配制成冷凍稀釋液。

1.4精液采集與常規(guī)品質(zhì)評(píng)定

選取膘情中等、體質(zhì)健康、性欲旺盛的小尾寒羊種公羊，用假陰道法采集精液，立即在37℃下進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)評(píng)定，要求原精液密度達(dá)到“密”級(jí)，活率在0.8以上，無(wú)異常氣味，色澤乳白，用于試驗(yàn)。

1.5 精液冷凍保存與解凍

1.5.1 精液的稀釋與平衡精液常規(guī)檢查后，將符合要求的新鮮精液根據(jù)活率和密度按3～6倍的比例，在35℃下用冷凍稀釋液等溫稀釋，混勻，在室溫下用0.25mL的塑料細(xì)管進(jìn)行分裝并封口。裹8～10層紗布置于4℃冰箱中平衡2～3h。

1.5.2 精液的冷凍與保存將平衡好的精液細(xì)管置于自制冷凍漂浮器上（距離液氮表面2.0～2.5cm，溫度在-110～-80℃）熏蒸10min，投入液氮保存。

1.5.3 精液的解凍從液氮罐中取出精液細(xì)管，迅速浸入39～40℃水浴中，輕輕搖動(dòng)直至融化（10～15s）。

1.6 精子活率的評(píng)定將稀釋精液搖勻后，取中層精液10μL滴于經(jīng)37℃恒溫板等溫預(yù)熱的載玻片上，蓋片后置于顯微鏡下放大400倍檢查精子1000個(gè)以上，分別計(jì)算呈直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)和總精子數(shù)，計(jì)算精子活率。

1.7 ATP酶活性的測(cè)定

1.7.1 ATP酶的提取精液總ATP酶粗提液:取120μL稀釋精液于離心管中，加入360μL0.2%TritonX-100，抽提20min，然后4000r/min離心30min，保留上清液待測(cè)。精清中ATP酶粗提液:取120μL稀釋精液于離心管中，加入自制稀釋液360μL2000r/min離心20min，保留上清液待測(cè)。精子中ATP酶粗提液:將上一步所得沉淀加入0.2%TritonX-100360μL抽提20min，4000r/min離心30min，保留上清液待測(cè)。

1.7.2 ATP酶活性的測(cè)定取純化水2.21mL，ATP溶液1.10mL，混勻后加入25℃預(yù)熱的ATP酶待測(cè)液0.19mL（空白管用純化水代替），迅速搖勻倒入比色皿（光徑為1cm），700nm處每隔1min測(cè)定1次OD值，每次測(cè)5min。

1.7.3 ATP酶活性的計(jì)算公式為:酶活力=（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）×1/（60×取樣量）×樣品稀釋倍數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性采用Excel軟件中數(shù)據(jù)分析工具庫(kù)進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)、t檢驗(yàn)和方差分析。試驗(yàn)重復(fù)5次以上。

2.結(jié)果與分析

結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與冷凍前相比，冷凍后小尾寒羊精子中ATP酶活性極顯著降低（P＜0.01），精清中ATP酶活性極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明冷凍保存對(duì)綿羊精子中ATP酶的活性造成了嚴(yán)重?fù)p傷。冷凍前后精子活率與精子ATP酶活性均呈極顯著正相關(guān)（r=0.979和0.968，P＜0.01），說(shuō)明精子ATP酶活性能夠反映精子活率，可作為精液品質(zhì)評(píng)價(jià)的指標(biāo)。MVE液氮罐